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📊 ORF検索結果・qPCR設計
🧪 qPCRプライマー候補はPrimer-BLASTで確認
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完全一致したRefSeq mRNAを使って、産物サイズ・Tm・GC%、Intron inclusionなどを設定済みのPrimer-BLASTを開けます。
🧪 推奨Primer-BLAST設定
📋 Primer Parameters
| PCR product size Min / Max | 70 / 200 |
| # of primers to return | 10 |
| Primer Tm Min / Opt / Max | 59.0 / 60.0 / 61.0 °C |
| Max Tm difference | 1 |
🧬 Exon / Intron Selection
| Intron inclusion | ✅ チェックON |
🔍 Primer Pair Specificity Checking
| Database | RefSeq mRNA |
| Organism | 9606 (Homo sapiens) |
| Primer specificity stringency | 2 mismatches |
⚙️ Advanced Parameters
| Primer Size Min / Opt / Max | 15 / 20 / 25 |
| Primer GC content Min / Max | 40 % / 60 % |
| Max Poly-X | 2 |
⑦ 候補が見つからない時の緩和設定
条件に合うプライマーが見つからない場合、上から順番に少しずつ緩和してください。
- Max Poly-X: 2 → 3
- 3′末端のT: 許容する（実際の論文でも多い）
- Tm: Min 58°C, Max 62°C に広げる
- 産物サイズ Max: 250 bp（あまり推奨しない）
- Intronが無い配列の場合: Intron inclusionのチェックを外す
※ プライマーは使ってみて初めて良し悪しがわかります。条件を緩めに設定し、出てきた中からベストを選ぶ姿勢が重要です。
上記の条件は「このmRNAでPrimer-BLASTを開く」ボタンから自動でPrimer-BLASTへ渡されます。